Institut für Nutztiergenetik (FLI)

Mit der Neuordnung der Ressortforschung des Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz BMELV und der damit verbundenen Auflösung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) wurde das Marienseer Institut als "Institut für Nutztiergenetik" am 01.01.2008 dem Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) zugeordnet.

Schwerpunkte der Forschungsarbeiten bilden Untersuchungen zur Charakterisierung genetischer Ressourcen, biotechnische Methoden zu deren Erhaltung sowie die Entwicklung informationstechnologischer Strategien, mit denen genetische Ressourcen auf globaler Ebene gehandhabt werden können. Reproduktionsbiologische Verfahren, wie die In-vitro-Produktion von Embryonen, das somatische Klonen und die Stammzell-Technologie bilden weitere Forschungsschwerpunkte. Das Institut bearbeitet außerdem Fragestellungen der molekularen Mikrobiologie und Antibiotikaresistenz, die im Zusammenhang mit der Diagnostik und Bekämpfung bakterieller Infektionen bei landwirtschaftlichen Nutztieren wichtig sind.

Wissenschaftler(in) des Instituts arbeiten in zahlreichen nationalen und internationalen Forschungsverbünden mit. Im Verbundprojekt RESET II wird der FLI-Partner IP 4 zu den Forschungsarbeiten in fünf Arbeitspaketen (work packages, WP) beitragen:

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Beschreibung der Projekte

Projekt 1: Identifizierung von ESBL-, PMQR-, AmpC β-Laktamase- und Carbapenemase-positive E. coli- und S. enterica-Isolaten

Gemäß vorab festgelegter international anerkannter Methoden, auf die sich die RESET Partner verständigt haben, untersucht jeder Partner das ihm zugängige Stammkollektiv/Material auf das Vorliegen von ESBL-, PMQR-, AmpC β-Laktamase- und Carbapenemase-positiven Isolaten. ESBL- und PMQR-positive Isolate werden detailliert genotypisch charakterisiert. Hierbei kommen die bereits in RESET I etablierten Methoden zum Einsatz. Die Isolate werden PFGE- und MLST-Analysen unterzogen und die entsprechenden Plasmide mittels Konjugation/Transformation, S1-Nuklease PFGE, Replikontypisierung und RFLP-Analysen charakterisiert. Weiterhin wird das genetische Umfeld der ESBL- und PMQR-Gene sowie weitere auf den Plasmiden lokalisierte Resistenzgene mittels PCR und Sequenzanalysen bestimmt.

Projekt 2: Vergleichende Analyse von ESBL-Genen und ESBL-positiven E. coli-Isolaten über die Zeit

Grundsätzlich sollen alle im Forschungsverbund vorhandenen ESBL-positiven Isolate in dieser Hinsicht untersucht werden. Zur besseren Vergleichbarkeit der Isolate wird der Schwerpunkt auf die E. coli-Isolate gelegt, die im Rahmen des Nationalen Resistenzmonitorings GERM-Vet auf jährlicher Basis gesammelt werden. Hierbei werden die ESBL-Gene zunächst tierart- und krankheitsspezifisch verglichen. Findet sich das gleiche ESBL-Gen in verschiedenen Isolaten, so werden diese Isolate und die entsprechenden ESBL-Plasmide näher charakterisiert, um Aussagen zum Vorkommen einzelner E. coli-Klone bzw. zum horizontalen Transfer bestimmter ESBL-Plasmide treffen zu können.

Projekt 3: Co-lokalisierte Biozidtoleranz auf ESBL-, AmpC β-Laktamase-, Carbapenemase- und/oder PMQR-Gene tragenden Plasmiden

Biozide (Triclosan, Akriflavin, Benzalkoniumchlorid, Chlorhexidin etc.) spielen eine wichtige Rolle als Desinfektionsmittel in Krankenhäusern und Tierkliniken, aber auch in der landwirtschaftlichen Tierhaltung. Inwiefern Gene für übertragbare Biozidtoleranz bei E. coli und S. enterica mit ESBL-, AmpC β-Laktamase-, Carbapenemase- und/oder PMQR-Genen auf Plasmiden co-lokalisiert vorkommen, soll hier untersucht werden. Dazu werden bereits komplett oder zum Teil sequenzierte Plasmide aus RESET I und RESET II verwendet. Diese Plasmide werden in definierte Empfängerstämme übertragen. Anschließend werden MHK-Werte für den „leeren“ Empfänger und den isogenen Transformanden/Transkonjuganden erstellt. Transformanden und Transkonjuganden mit deutlich erhöhten Biozid-MHK-Werten werden dann auf die Präsenz von Genen, die Biozidtoleranz vermitteln können, bspw. Gene für Effluxproteine der „Major Facilitator Superfamily (MFS)“, der „Small Multidrug Resistance (SMR) family“ sowie der „Resistance/Nodulation/cell Division (RND) family“ untersucht. Detektierte Gene dieser Familien werden kloniert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit einen Biozidtoleranz-Phänotyp zu vermitteln untersucht.

Projekt 4: Molekulare Charakterisierung von Isolaten, die in Gegenwart niedriger Wirkstoffkonzentrationen Resistenz entwickelt haben.

Diese Arbeiten werden in enger Zusammenarbeit mit IP 7 durchgeführt. Die zur Inokulation von Hühnern verwendeten empfindlichen E. coli-Ausgangsisolate sowie Isolate, die im Zuge des Kontakts mit niedrigen Wirkstoffkonzentrationen Resistenz entwickelt haben, werden von IP 7 zur Verfügung gestellt und von IP 4 vergleichend mittels PFGE untersucht. Die PFGE Muster geben im Zusammenhang mit den MHK-Werten Aufschluss darüber, ob es sich bei den resistenten E. coli-Isolaten um die zur Inokulation verwendeten Isolate handelt, die im Versuchsverlauf Resistenz entwickelt haben.

Projekt 5: Gesamtgenom- und Gesamtplasmidanalysen

In diesem Aufgabenpaket wird IP 4 Unterstützung beim Lückenschluss zwischen den Contigs und bei der Annotierung der von IP 9 erarbeiteten Gesamtgenom- und Gesamtplasmidsequenzen leisten. IP 4 verfügt über erhebliche Erfahrung auf den Gebieten „de-novo Zusammensetzung von Genomen“, „Lückenschluss“ und „Annotierung“. Zudem wurden bereits einige große Plasmide von Enterobacteriaceae in IP 4 komplett sequenziert und annotiert, so dass das Forschungskonsortium hier von der Erfahrung der Wissenschaftler in IP 4 profitieren wird.

Projekt 6: Bestimmung von Virulenzmustern

Zum Nachweis von Virulenzgenen bei E. coli kommt ein kommerziell erhältlicher DNA Microarray (Identibac E. coli Genotyping, Alere Technologies, Jena) zum Einsatz. Dieser Microarray enthält 146 Sonden in dreifacher Ausführung, die insgesamt 92 Virulenzgenen bzw. deren Allelen entsprechen. Zur Untersuchung mit diesem Microarray werden E. coli-Isolate aus RESET I oder RESET II verwendet, die Plasmide besitzen, welche (i) ESBL-, AmpC β-Laktamase-, Carbapenemase- und/oder PMQR-Gene tragen, (ii) verschiedene Replikontypen repräsentieren und/oder (iii) unterschiedliche Größen zeigen. Diese Plasmide werden in einen definierten Empfängerstamm verbracht; anschließend werden „leerer” Empfänger und Transkonjugand/Transformand vergleichend mit dem Mikroarray untersucht. Dieser Ansatz gibt erste Hinweise darauf, ob Virulenz- und Resistenzgene auf dem gleichen Plasmid zu finden sind. Zur Bestätigung der funktionellen Aktivität der Virulenzgene kommen anschließend spezifische RT-PCRs zum Einsatz.

Projekt 7: Transfer von ESBL-, AmpC β-Laktamase-, Carbapenemase- und/oder PMQR-Gen tragenden Plasmiden in E. coli mit unterschiedlichem pathogenen Potenzial

Gut charakterisierte konjugative und nicht-konjugative ESBL-Plasmide aus RESET I werden verwendet, um deren Verbreitung in Stämme mit variablem pathogenen Potenzial zu untersuchen. Definierte komplett sequenzierte ESBL-Plasmide werden in vitro durch den Einbau eines Gens für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) modifiziert. Isolate mit einem derart modifizierten ESBL-Plasmid werden anschließend in Co-Kultivierungsassays unter in vitro Bedingungen eingesetzt. Als potenzielle Empfänger dienen hierbei entweder (i) definiert pathogene Stämme aus den Stammsammlungen der RESET Partner oder (ii) physiologische Microbiota von Menschen und Tieren. In diesen Experimenten sollen die in vitro Transferraten der ESBL-Plasmide unter verschiedenen Bedingungen getestet werden, z.B. in Gegenwart verschiedener antimikrobieller Wirkstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen.

Projekt 8: Gemeinsame Datenanalyse unter Einbeziehung aller Partner

Wie bereits bei RESET I, so wird IP 4 auch für RESET II alle für die gemeinsame Datenanalyse relevanten Informationen bereitstellen. Dies betrifft insbesondere die Subtasks in IP 2 (BfR-Epi) und IP 6 (TiHo-Epi), die sich mit den statistischen Analysen sowie der Risikobewertung der multivariaten phänotypischen und genotypischen Resistenzdaten beschäftigen.

Projekt 9: Förderung von Nachwuchswissenschaftlern

Die Förderung junger Wissenschaftler (Doktoranden, PhD-Studenten und Post-Docs) des RESET Konsortiums wird im FLI-Labor während der gesamten 3-jährigen Projektperiode angeboten.