Bundesinstitut für Risikobewertung, Abteilung Biologische Sicherheit (BfR-Resi)
Das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) hat den gesetzlichen Auftrag, Risiken im Bereich des gesundheitlichen Verbraucherschutzes zu erkennen und zu bewerten. Die Abteilung Biologische Sicherheit befasst sich mit der Bewertung von Risiken, die von Mikroorganismen, Toxinen und anderen mikrobiellen Stoffwechselprodukten ausgehen und etabliert diagnostische Verfahren zum Erregernachweis in Lebensmitteln. Zudem bearbeitet sie Fragen der Überwachung, Ausbreitung und Bekämpfung von Infektionskrankheiten entlang der Lebensmittelkette.
Als Partner BfR-Resi in diesem Verbund ist es unsere Aufgabe, mittels harmonisierter molekularbiologischer Methoden ESBL-produzierende Salmonella enterica und E. coli zu identifizieren und zu charakterisieren. Zusätzlich sollen diese Isolate auf die zugrundeliegenden Resistenzgene für ESBL und (Fluor-) Chinolon Resistenzen einschließlich der genetischen Umgebung dieser Gene und die sie tragenden Strukturen (Plasmide, Integrons, Transposons) untersucht werden. Abschließend soll mittels molekularer Typisierung einschließlich von MLVA- und PFGE-Analysen die klonale Verwandtschaft der Salmonella enterica und E. coli-Isolate beleuchtet werden.
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Beschreibung der Projekte
Ermittlung und Verteilung bereits existierender Isolate (AP 3)
Zu Projektbeginn wird eine Überarbeitung der Daten zu den an den Nationalen Referenzlaboren des BfR erfassten Isolaten stattfinden. In den letzten Jahren haben in Europa mehrere Aktivitäten zur Harmonisierung von Untersuchungsmethoden, Testsubstanzen und Resistenz-Bewertungskriterien stattgefunden. Aus diesem Grund wurden im Januar 2008 die in unserem Labor verwendeten Testsubstanzen und Bewertungskriterien den neuen EU-Leitlinien angepasst. Deshalb werden nur vorhandene Isolate berücksichtigt, die ab Januar 2008 am BfR gesammelt wurden. Es werden die Isolate ausgesucht, die eine MHK für Cefotaxim von ≥ 2 µg/ml haben. Ausgewählte Isolate von S. enterica und E. coli werden den Projektpartnern für die weiterführende molekulare Typisierung zugesandt. Ausgewählte Isolate werden de Partner Uni-Gießen für die Plasmid-Sequenzierung bereitgestellt.
Resistenztestung (AP 3)
Isolate, die in AP 2 gewonnen werden, sollen bezüglich ihrer Resistenz gegenüber antimikrobiellen Stoffen unter Verwendung der CLSI Mikrodilutionsmethode getestet werden. Unter den getesteten Substanzen befinden sich ß-Lactame (Ampicillin, Cefotaxim und Ceftazidim) und (Fluor-) Chinolone (Nalidixinsäure und Ciprofloxacin), wie von EUCAST (www.eucast.org) empfohlen, sowie zahlreiche weitere ß-Lactame (Penicilline, 1. bis 4. Generation Cephalosporine, Peneme und Monobactame) und ß-Lactamase-Inhibitoren.
Ermittlung und Charakterisierung von ESBL Enzymen und Resistenzgenen (AP 3)
In diesem Projekt sollen alle für diese Studie ausgewählten Isolate auf das Vorhandensein verschiedener bla Gene, die die ß-Lactam Resistenz vermitteln, mittels PCR-Amplifikation und Sequenzierung untersucht werden. Die Ermittlung der (Fluor-) Chinolon Resistenz vermittelnden Gene qnrA, B, C, S, D, qepA (in allen Isolaten) und aac(6)-lb (in allen Kanamycin/Gentamicin resistenten Isolaten) sowie die Detektion von Integrons der Klasse 1 sollen ebenfalls per PCR durchgeführt werden. Die ermittelten Sequenzen werden mit den vorhandenen Sequenzen in der GenBank Datenbank verglichen. Die genetische Umgebung der ermittelten ESBL Gene soll anhand von PCR/Sequenzierung mit spezifischen Primern für unterschiedliche Insertionssequenzen (z. B. IS26 und ISEcp1) analysiert werden. Der isoelektrische Punkt der ß-Lactamasen soll mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) unter Verwendung des Phast Systems (GE Healthcare) ermittelt werden.
Molekulare Typisierung der Salmonella enterica Isolate (AP 3)
Innerhalb dieses Projekts werden zentral alle von den verschiedenen Projektpartnern ausgewählten Salmonella enterica Isolate bezüglich ihrer Makrorestriktionsprofile der genomischen DNS mit der Restriktionsendonuklease Xba I (PFGE) typisiert. Dafür soll das standardisierte Protokoll von PulsNet (www.pulsnet-europe.org) befolgt werden. Zusätzlich wird die Multilocus Variable Tandemrepeat Analyse (MLVA) zur weitergehenden Typisierung der Isolate eingesetzt.
Plasmidcharakterisierung (AP 3)
Um Plasmide besser zu visualisieren und ihre Größe präziser ermitteln zu können, sollen S1-Nukleaseverdauungen der Gesamt-DNS, gefolgt von PFGE, durchgeführt werden. Um die Lokalisation der nachgewiesenen Resistenzgene auf Plasmiden zu bestätigen, soll die DNS mittels Southern-Blot auf Nylonmembranen übertragen werden und mit spezifischen DNS-Sonden für die unterschiedlichen ß-Lactam- und (Fluor-) Chinolon-Resistenzgene hybridisiert werden. Konjugations- und Transformationsexperimente sollen an ausgewählten Isolaten durchgeführt werden. Ausgewählte Plasmide werden Inkompatibilitätsgruppen mittels der PCR-basierten inc/rep Typisierungsmethode zugeordnet werden. Einige der identifizierten Plasmide sollen partiell sequenziert werden.